1. Định nghĩa về màng sinh học

Màng sinh học (biofilm) được định nghĩa là một tập hợp của vi sinh vật liên kết với nhau thông qua mạng lưới polymer ngoại bào. Màng sinh học có thể hình thành do tập hợp các tế bào của cùng một vi sinh vật hay các vi sinh vật khác nhau. Trong tự nhiên, màng sinh học thường là sự liên kết của vi khuẩn, nấm, tảo, xạ khuẩn. Trong màng sinh học các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc.

Định nghĩa về màng sinh học

Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành màng cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể.

2. Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học

Cấu trúc của màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính là các tập hợp tế bào vi sinh vật và mạng lưới các chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances - EPS). Các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám dính trên bề mặt nhất định (có thể là hữu sinh hay vô sinh). Các tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào.

Bảng 1: thành phần của màng sinh học

Có thể nói màng sinh học là dạng sống khá phổ biến của nhiều loài vi sinh vật. Mạng lưới các chất ngoại bào (EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm. Mạng lưới ngoại bào có độ dày từ 0,2 đến 1 µm. Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn nằm trong khoảng từ 10 đến 30 nm.

Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm nhờ đó mà các chất dinh dưỡng cũng như nước có thể lưu thông trong biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào vi sinh vật trong biofilm cũng như loại bỏ đi những chất thải không cần thiết.

Về cơ bản màng sinh học được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm từ 2 đến 5% tổng khối lượng biofilm. Trong biofilm ngoài thành phần tế bào thì có tới 97% là nước, 3 đến 6% còn lại là EPS và ion. Một tế bào vi khuẩn tùy thuộc vào điều kiện môi trường khác nhau có thể hình thành biofilm ở các dạng khác nhau. Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện hình thành nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng từ 40 đến 95%, từ 1 đến 60% là protein, từ 1 đến 10% là axit nucleic, và từ 1 đến 40% lipit về khối lượng.

Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời gian tồn tại của màng sinh học. Về cơ bản màng sinh học càng dày và thời gian tồn tại càng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều. Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu. Trái lại, thành phần EPS lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành phần EPS trong biofilm cũng khác biệt so với ở dạng sống tự do của chính vi khuẩn đó.

EPS có thể chiếm 50% đến 90% của tổng cacbon hữu cơ của các màng sinh học và có thể coi là thành phần chính của màng sinh học. EPS có thể thay đổi một vài tính chất hóa học và vật lý, nhưng thành phần chính của nó chủ yếu vẫn gồm các polysaccharides. Có thể là các polysaccharides trung tính hay là polyanionic là thành phần chính của EPS vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn gram dương, thành phần hóa học của EPS có thể khác nhau và chủ yếu là cation.

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc của màng sinh học, các nhà khoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản. Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật.

Nhờ đó, dịch tế bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải. Sự hình thành biofilm là quá trình phát triển mà trong đó vi khuẩn trải qua những thay đổi trong cách thức tồn tại để chuyển từ dạng sống đơn bào, riêng rẽ sang dạng tập hợp nhiều tế bào, cố định một chỗ và có sự sinh trưởng cũng như biệt hóa tế bào khác với dạng sống trôi nổi.

Có năm giai đoạn chính trong quá trình hình thành và phát triển của một biofilm.

Hình 1. Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm

1. Giai đoạn gắn kết, 2. Hình thành lớp tế bào, 3. Hình thành mạng lưới ngoại bào, 4. Hình thành màng sinh học hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời

Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch lên giá thể

Trong một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi hóa ứng động và hình thành mối tương tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro.

Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ được bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật. Giai đoạn gắn kết thuận nghịch có vai trò quyết định một màng sinh học có thể được hình thành hay không.

Giai đoạn 2: Hình thành lớp tế bào

Khi các tế bào đầu tiên bám dính chặt hơn trên bề mặt giá thể, lúc này các tế bào sử dụng các chất hữu cơ trên bề mặt giá thể và trong môi trường để sinh trưởng phát triển tạo nên các vi khuẩn lạc đồng thời cũng trải qua những thay đổi về số lượng tế bào, số lượng loài cũng như cấu trúc tế bào nhất định.

Sản sinh ra các hợp chất ngoại bào, giúp cho các tế bào bám dính chặt, không thuận nghịch trừ khi có tác động của các tác nhân vật lý, hóa học. Các tế bào giảm mức độ sinh trưởng, tiêu giảm các phần phụ trợ tế bào.

Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới ngoại bào

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường. Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh học cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một màng sinh học dần được hình thành.

Giai đoạn 4: Hoàn thành một màng sinh học hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Các tế bào phân chia và phát triển, hình thành các cụm tế bào vi khuẩn và mở rộng về không gian, hình thành một cấu trúc màng sinh học hoàn chỉnh. Từ một phạm vi ban đầu màng sinh học có thể mở rộng về không gian cũng như độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Một màng sinh học hoàn chỉnh có cấu trúc giống như tháp hình nấm được bao quanh bởi các kênh vận chuyển nước có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy vào bên trong màng.

Giai đoạn 5: Quá trình tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh học bị giới hạn do nhu cầu dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy.

Trong một số trường hợp, khi màng sinh học đạt đến khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc. Sự phân hủy các polymer ngoại bào có thể diễn ra trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng hay oxy bên trong màng sinh học.

Quá trình này liên quan đến sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa cho enzyme phân hủy carbohydrate tạo nên các lực liên kết yếu hơn trong màng sinh học, dẫn đến sự phân tách các tế bào riêng rẽ đồng thời operon mã hóa cho protein lông roi được tăng cường biểu hiện để chuẩn bị cho các tế bào sống tự do khi tách rời khỏi màng.

3. Vai trò và ứng dụng của sự hình thành màng sinh học

3.1. Vai trò của sự hình thành màng sinh học

Sự hình thành màng sinh học mang lại lợi ích cho chính bản thân vi sinh vật. Trong quá trình hình thành màng sinh học, các tế bào phải trải qua một số thay đổi về hình thái, đặc tính sinh lý và một trong những thay đổi quan trọng là việc hình thành mạng lưới các chất ngoại bào bao quanh. Mạng lưới này giúp giữ lại chất hữu cơ không hòa tan từ môi trường nước xung quanh tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển. Đồng thời nó cũng có vai trò trong việc kiến tạo cấu trúc không gian 3 chiều đặc trưng cho màng sinh học bằng cách tạo nên một mức độ ổn định, một sự cân bằng nội môi cho các vi sinh vật.

Bên cạnh đó một vai trò quan trọng của mạng lưới ngoại bào là đem lại khả năng chống lại các tác nhân kháng khuẩn cho các tế bào sinh sống trong một màng sinh học. Theo Flemming, vi khuẩn có thể có khả năng kháng đối với các tác nhân gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt...) cao gấp 1000 lần khi gắn kết với nhau tạo thành màng sinh học so với tế bào sống trôi nổi. Mạng lưới các hợp chất ngoại bào cũng được ghi nhận có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của kim loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế bào tránh khỏi rất nhiều yếu tố gây tác động xấu tới vi sinh vật từ môi trường như tia UV, pH, sốc thẩm thấu và sự khô hạn.

Những kênh vận chuyển nước nằm xen kẽ trong cấu trúc của màng sinh học, giữa các vùng bao quanh vi khuẩn lạc được ví như là một hệ thống tuần hoàn. Chúng hoạt động hiệu quả trong quá trình trao đổi chất với môi trường xung quanh, do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dưỡng cũng như loại bỏ các sản phẩm chuyển hóa có khả năng gây độc hại. Nhờ vậy quá trình chuyển hóa các chất trong đó cũng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do.

Mặt khác quá trình hình thàng màng sinh học giúp vi sinh vật tận dụng được nguồn chất hữu cơ bám dính trên bề mặt giá thể cũng như các cơ chất, chất dinh dưỡng tạo ra từ các loài vi sinh vật khác sống chung. Một màng sinh học có thể được hình thành do sự hợp tác cùng chung sống của nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp.

Các loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm. Chẳng hạn như những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao trong khi những loài nằm phía trung tâm biofilm có xu hướng chịu được nồng độ oxy thấp (vi hiếu khí).

Khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng được nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hưởng lớn đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Hầu hết các quá trình trong tự nhiên đòi hỏi sự phối hợp của nhiều nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau cùng cư trú trong biofilm sẽ góp phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn.

Quá trình truyền gen ngang đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật. Trong đó cơ chế truyền gen phổ biến ở vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên từ những hiểu biết rằng hầu hết các vi khuẩn trong tự nhiên định cư dưới dạng biofilm, liên kết với nhau bởi mạng lưới các chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ đó vi khuẩn trong biofilm có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác.

3.2. Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm

Màng sinh học tác động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày. Do vậy nhiều nghiên cứu hiện nay về màng sinh học có ý nghĩa thực tiễn quan trong và ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Một số ứng dụng cụ thể của màng sinh học nói riêng và các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học nói chung là xử lý ô nhiễm.

Trong công nghiệp lên men tại các bể lên men là nơi giữ lại sinh khối vi sinh vật. Thông thường các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng được giữ lại trong các bồn lên men sau mỗi mẻ xử lý. Khi đó để tiếp tục một qui trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Qui trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành.

Mang sinh học được tạo ra trên giá thể di động trong hệ thống xử lý nước thải

Ngược lại khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý. Những giá thể chất mang có sẵn mạng lưới biofilm có thể được tái sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà không phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.

Dầu thô và các sản phẩm từ dầu được loại bỏ bởi các vi khuẩn phân hủy hydrocarbon. Các vi khuẩn được sử dụng có thể được thả trực tiếp xuống vùng dầu tràn hoặc có thể thả ở vùng ven bờ mà dầu tràn bị sóng đánh vào. Lý do chính ở đây là biofilm giúp tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dính của vi sinh vật với bề mặt giá thể nơi có dầu tràn. Trong nghiên cứu của Radwan và cộng sự, khi sử dụng các vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter và dùng một lớp phủ làm giá thể cho vi khuẩn là tảo, kết quả đã làm giảm được 64-98% n-octadecane và khoảng 38-56% phenanthrene từ môi trường có chứa 0,03% của hydrocarbon sau 2 tuần.

Trong nghiên cứu của Lê Thị Nhi Công cùng cộng sự, đã phân lập từ biển nhóm vi khuẩn tạo biofilm và có hoạt tính chuyển hóa các chất hydrocacbon thơm đa vòng như napthalene, anthracene, pyren.

Một trong những ứng dụng của màng sinh học đang được quan tâm liên quan đến việc làm sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm bằng công nghệ sinh học. Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thân vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ trong môi trường tự nhiên thành các chất vô cơ đơn giản, ít độc.

Đã có nhiều phương pháp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đó nước thải được lọc qua các biofilm nhằm mục đích tách và đồng hóa các hợp chất hữu cơ có hại. Một lượng sinh khối lớn các vi sinh vật trong mạng lưới biofilm làm tăng sự hợp tác trong quá trình trao đổi chất, giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước diễn ra hiệu quả hơn so với dạng sống tự do.

Quá trình phân hủy các chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản phẩm của chủng này lại là cơ chất cho một chủng khác trong mạng lưới biofilm, ví dụ trong một mạng lưới biofilm xử lý nước thải có chứa hợp chất nitơ, ion NH4+ được nhóm Nitrosomonas, Nitrobacter chuyển hóa thành ion NO3-, rồi tiếp tục được các nhóm vi khuẩn yếm khí khác sử dụng để cuối cùng tạo thành N2 đi vào khí quyển.

Một số nghiên cứu về vi khuẩn anammox có khả năng xử lý nitơ trong nước thải, đã chỉ ra rằng trong hệ thống các lớp siêu mỏng của lớp màng biofilm của chủng vi khuẩn Planctomycetes có sự phân bố oxy theo lớp. Các lớp phía trên là những lớp giàu oxy trong khi các lớp ở phía dưới cùng nằm trong trạng thái kị khí. Sự phân chia theo lớp màng sinh học sẽ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình ứng dụng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ vì giai đoạn nitrate hóa là giai đoạn hiếu khí, giai đoạn khử nitrate là giai đoạn kị khí.

Những nghiên cứu về biofilm trong xử lý nước thải có chứa các hợp chất nitơ và photpho của Boelee và cộng sự, các nhà nghiên cứu đã sử dụng màng sinh học của vi tảo để thực hiện nghiên cứu này. Kết quả cho thấy, màng sinh học được thiết kế dựa vào các vi tảo đã xử lý được nitơ là 1.0 g/m2/ngày và photpho là 0.13 g/m2/ngày.

Wellander và cộng sự khi sử dụng một vật liệu bám sinh khối, thả nổi trong hệ thống xử lý làm giá thể cho các vi sinh vật có khả năng nitrate hóa, đã loại bỏ được đến 90% lượng nitơ tổng số. Hoilijoki và cộng sự đã nghiên cứu khả năng nitrate hóa của vi sinh vật thuộc nhóm nitrate hóa. Kết quả cho thấy, quá trình nitrate hóa chỉ xử lý được 61% amoni khi không có vật liệu bám cho vi sinh vật, và quá trình nitrate hóa xảy ra hoàn toàn khi có vật liệu bám cho vi sinh vật trong bể phản ứng bùn hoạt tính.

Kết quả này cho thấy, quá trình xử lý nước thải sử dụng màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý khi có mặt vật liệu bám cho vi sinh vật. Bernet và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng khả năng chuyển hóa nitơ và tạo màng sinh học của vi sinh vật. Mẫu ban đầu có hàm lượng NH4+ là 250 mg/l, sau 2 ngày, hàm lượng NH4+ giảm xuống chỉ còn 5 mg/l, hiệu quả của quá trình xử lý lên đến 98%.

Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học trong xử lý ô nhiễm nước thải đặc biệt là nước thải giàu nitơ và photpho hiện nay chưa nhiều. Các công trình công bố liên quan đến lĩnh vực ứng dụng nghiên cứu này chưa nhiều, còn thiếu cả về số lượng lẫn chất lượng. Tại Việt Nam tình hình ô nhiễm nước thải ngày một gia tăng do đó việc cấp thiết là tìm một phương pháp xử lý hiệu quả là cần thiết.

Vì vậy, để phù hợp với mục đích nghiên cứu và ứng dụng xử lý ô nhiễm tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài phân lập nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học và có khả năng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho với mục tiêu: Phân lập các chủng có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có khả năng xử lý nitơ và photpho Bước đầu nghiên cứu tối ưu các điều kiện cho sự sinh trưởng phát triển của các chủng vi sinh vật này để có thể áp dụng trong công nghệ xử lý nước thải giàu nitơ và photpho.